BOUTIQUE精品展示
截至目前，ELISA方法仍是工藝監(jiān)測和產(chǎn)品批次放行中檢測并定量HCP的金標(biāo)準(zhǔn)。Cygnus提供HCP 檢測試劑盒已經(jīng)超過25年，開發(fā)了許多專利方法生產(chǎn)對HCP具有廣泛反應(yīng)性的抗體，目前提供超過32種不同的表達(dá)平臺的HCP ELISA檢測試劑盒。
Cygnus的ELISA試劑盒使用預(yù)包被板，檢測同時加入抗原與檢測抗體進(jìn)行孵育。HCP檢測實際上相當(dāng)復(fù)雜，主要依賴于能夠?qū)?shù)千種HCP產(chǎn)生反應(yīng)的HCP抗體，要使 ELISA檢測的結(jié)果準(zhǔn)確，針對抗原的捕獲和檢測抗體必須都要過量。只有在抗體過量的條件下，才能得到正斜率的劑量曲線，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確的定量。因此，合理的孔板布局設(shè)置是一個很好的開始。
Cygnus HCP ELISA檢測基本流程
一、HCP ELISA布板規(guī)范
1. 復(fù)孔要求
推薦采用三復(fù)孔設(shè)計，三個復(fù)孔是最有效的做法，可以發(fā)現(xiàn)并去除可能出現(xiàn)的異常值，在完成實驗后做問題排查時能提供更多信息。需要注意的是，如果檢測樣品數(shù)量不支持設(shè)置三復(fù)孔，那么最少要設(shè)置雙復(fù)孔，沒有復(fù)孔的檢測是無效的。如果可以的話，最好對標(biāo)準(zhǔn)品和對照品設(shè)置三復(fù)孔。
2. 空白對照
不建議設(shè)置額外的空白對照，扣除空白對照不會改善實驗結(jié)果，甚至還會導(dǎo)致CV值升高。詳情請參考《使用Cygnus ELISA試劑盒該如何設(shè)置空白對照？》。
3. 設(shè)置陽性對照。
使用處于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照（低濃度標(biāo)準(zhǔn)品受靈敏度影響較大）。當(dāng)使用來自HCP標(biāo)準(zhǔn)品的陽性對照時，曲線中間的濃度點通常會提供最多的信息。
4. 設(shè)置陰性對照
使用樣品稀釋液作為空白對照，從而評估0濃度標(biāo)準(zhǔn)品與所使用的稀釋液之間是否存在顯著偏差。
5. 設(shè)置1-2個額外的HCP對照
可以使用工藝流程中的一個已經(jīng)過充分表征的在制品樣品作為額外的HCP對照。有富余孔的條件下，設(shè)置兩個稀釋度會比只有一個稀釋度效果更好。
6. 使用低結(jié)合板優(yōu)化加樣步驟
在向孔板加樣時，最重要的是要思考完成每一步驟需要多長時間，每一步驟的移動方向是什么。對于這種情況，預(yù)先將待檢樣品和酶標(biāo)二抗加入低結(jié)合板內(nèi)，然后再整個轉(zhuǎn)移到檢測孔板中，這樣能夠大幅減少將樣品添加到檢測板時造成的加樣誤差。
二、ELISA布板示例
樣品布板的最佳方式是將標(biāo)準(zhǔn)品置于板的左側(cè)，將對照品（陰性或陽性對照）置于板的右側(cè)，同時還要考慮需要設(shè)置的復(fù)孔數(shù)量，樣品稀釋梯度，以及在加樣和洗板時的移動方向。將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品分別置于板的兩側(cè)，確保可以從孔板的任意一側(cè)都能獲取相同的信息。這樣能夠清晰地反映出在加樣時或洗板過程中可能出現(xiàn)的任何操作失誤，而且通過改變這些孔在板內(nèi)的位置能夠更好地進(jìn)行問題排查。
- 三復(fù)孔布板推薦示意圖
5個樣品4個稀釋梯度，所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及對照品都設(shè)置三個復(fù)孔
- 雙復(fù)孔布板推薦示意圖
4個樣品和加標(biāo)控制品都設(shè)置4稀釋梯度，所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及對照品都設(shè)置雙復(fù)孔
- 未知濃度HCP樣品布板推薦示意圖
4個樣品8個稀釋梯度，以便收集未知HCP水平樣品的大部分信息。
更多布板示例文末獲取。
三、HCP ELISA布板常見問題排查及解決辦法
1. 加樣問題
在HCP ELISA檢測過程中，每2分鐘的靜態(tài)孵育相當(dāng)于1分鐘的震蕩孵育。也就是說，如果加樣耗費(fèi)了20分鐘，就相當(dāng)于最先加入的樣品比最后加入的樣品多孵育了10分鐘。假如震蕩孵育的時間為1個小時，而加樣就花費(fèi)了20分鐘，那么勢必會導(dǎo)致前后加入的樣品結(jié)合效率有差異，結(jié)果表現(xiàn)為最先加入的樣品會得到偏高的OD值。因此，加樣的原則是要確保板內(nèi)所有孔的孵育時間盡可能一致。如果一次需要檢測的樣品數(shù)量較多，為了避免在加樣過程耗費(fèi)太多時間，我們建議先將樣品和酶標(biāo)抗體加入低結(jié)合板中，然后再用排槍快速轉(zhuǎn)移到檢測板內(nèi)。實踐證明，這種操作方法可以有效改善因加樣時間差而導(dǎo)致的結(jié)果異常問題。
2. 洗板問題
不合理的洗板操作也會導(dǎo)致檢測結(jié)果的異常，與加樣操作類似，HCP ELISA洗板需要遵循的核心原則就是交替方向洗板，也就是盡可能確保所有孔的總清洗時間一致。關(guān)于洗板操作的注意事項請參考《如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測結(jié)果漂移的問題？》
四 常見錯誤案例與改進(jìn)辦法
案例一 加樣緩慢造成的誤差
如果同一個樣品依次從A到H行，按照1到12列方向逐孔緩慢加樣，即使采用了正確的洗板方式，這種加樣方式也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。以下熱圖示例展示了如果將相同的樣品以緩慢的速度加入孔板會發(fā)生的情況。
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1 |
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3 |
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5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
1.000 |
0.976 |
0.952 |
0.928 |
0.904 |
0.880 |
0.856 |
0.832 |
0.808 |
0.784 |
0.760 |
0.736 |
|
B |
0.997 |
0.973 |
0.949 |
0.925 |
0.901 |
0.877 |
0.853 |
0.829 |
0.805 |
0.781 |
0.757 |
0.733 |
|
C |
0.994 |
0.970 |
0.946 |
0.922 |
0.898 |
0.874 |
0.850 |
0.826 |
0.802 |
0.778 |
0.754 |
0.730 |
|
D |
0.991 |
0.967 |
0.943 |
0.919 |
0.895 |
0.871 |
0.847 |
0.823 |
0.799 |
0.775 |
0.751 |
0.727 |
|
E |
0.988 |
0.964 |
0.940 |
0.916 |
0.892 |
0.868 |
0.844 |
0.820 |
0.796 |
0.772 |
0.748 |
0.724 |
|
F |
0.985 |
0.961 |
0.937 |
0.913 |
0.889 |
0.865 |
0.841 |
0.817 |
0.793 |
0.769 |
0.745 |
0.721 |
|
G |
0.982 |
0.958 |
0.934 |
0.910 |
0.886 |
0.862 |
0.838 |
0.814 |
0.790 |
0.766 |
0.742 |
0.718 |
|
H |
0.979 |
0.955 |
0.931 |
0.907 |
0.883 |
0.859 |
0.835 |
0.811 |
0.787 |
0.763 |
0.739 |
0.715 |
改進(jìn)辦法：預(yù)先在低結(jié)合板中加入酶標(biāo)抗體和樣品，之后再用排槍將所有樣品快速轉(zhuǎn)移到檢測板中進(jìn)行孵育。這樣可以有效減少不同孔加樣的時間差，確保所有孔的孵育時間盡可能一致，進(jìn)而降低異常值出現(xiàn)的概率。
案例二 同一個方向洗板造成的誤差
如果4次洗板都是同一個方向加入洗液的話，也會對檢測結(jié)果造成影響。以下熱圖示例展示了4次洗板都是用排槍按照1到12列加入洗液可能發(fā)生的情況。
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1 |
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3 |
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6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
B |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
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C |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
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D |
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0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
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E |
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0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
F |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
G |
|
0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
|
H |
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0.670 |
0.700 |
0.730 |
0.760 |
0.790 |
0.820 |
0.850 |
0.880 |
0.910 |
0.940 |
0.970 |
1.000 |
改進(jìn)辦法：建議采用交替方向的方式洗板，也就是第1和3次洗板與第2和4次洗板要從相反的方向加入洗液。
五 HCP ELISA結(jié)果異常案例與問題排查
如下圖所示，該檢測結(jié)果樣品復(fù)孔之間出現(xiàn)自左向右的降低的趨勢，且孔板右側(cè)的陰性對照和陽性對照的OD值都比左側(cè)低。通過兩側(cè)陽性對照結(jié)果不一致可以判定此次實驗是失敗的。此外，左側(cè)陰性對照復(fù)孔之間OD值的平均差異為0.01，而右側(cè)陰性對照的OD值則接近背景水平，因此還需更多信息來進(jìn)一步判斷問題來自加樣還是洗板。
綜上所述，本次實驗失敗的原因可能為：1、加樣太慢；2、洗板沒有交替方向的操作。
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1 |
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3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
STD 1 |
Sample 1 Dilution 1 |
Sample 3 Dilution 1 |
Sample 5 Dilution 1 |
||||||||
|
B |
STD 2 |
Sample 1 Dilution 2 |
Sample 3 Dilution 2 |
Sample 5 Dilution 2 |
||||||||
|
C |
STD 3 |
Sample 1 Dilution 3 |
Sample 3 Dilution 3 |
Sample 5 Dilution 3 |
||||||||
|
D |
STD 4 |
Sample 1 Dilution 4 |
Sample 3 Dilution 4 |
Sample 5 Dilution 4 |
||||||||
|
E |
STD 5 |
Sample 2 Dilution 1 |
Sample 4 Dilution 1 |
Negative Control (Diluent) |
||||||||
|
F |
STD 6 |
Sample 2 Dilution 2 |
Sample 4 Dilution 2 |
Control Dilution 1(External HCP) |
||||||||
|
G |
STD 7 |
Sample 2 Dilution 3 |
Sample 4 Dilution 3 |
Control Dilution 2 (External HCP) |
||||||||
|
H |
STD 8 |
Sample 2 Dilution 4 |
Sample 4 Dilution 4 |
Postive Control (STD 5 repeat) |
||||||||
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
2.500 |
2.450 |
2.400 |
1.200 |
1.150 |
1.100 |
2.000 |
1.950 |
1.900 |
1.700 |
1.650 |
1.600 |
|
B |
1.200 |
1.150 |
1.100 |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
1.000 |
0.950 |
0.900 |
0.850 |
0.800 |
0.750 |
|
C |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
0.300 |
0.280 |
0.260 |
0.500 |
0.480 |
0.460 |
0.425 |
0.405 |
0.385 |
|
D |
0.300 |
0.250 |
0.200 |
0.150 |
0.140 |
0.130 |
0.250 |
0.240 |
0.230 |
0.212 |
0.202 |
0.192 |
|
E |
0.150 |
0.130 |
0.110 |
1.400 |
1.350 |
1.300 |
0.125 |
0.115 |
0.105 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
|
F |
0.075 |
0.065 |
0.055 |
0.700 |
0.650 |
0.600 |
0.550 |
0.500 |
0.450 |
0.230 |
0.225 |
0.220 |
|
G |
0.038 |
0.033 |
0.028 |
0.350 |
0.330 |
0.310 |
0.290 |
0.270 |
0.250 |
0.115 |
0.095 |
0.075 |
|
H |
0.015 |
0.010 |
0.005 |
0.175 |
0.165 |
0.155 |
0.145 |
0.135 |
0.125 |
0.090 |
0.080 |
0.070 |
總結(jié)
? 在ELISA實驗之前應(yīng)該合理規(guī)劃孔板布局：優(yōu)化的孔板布局能夠監(jiān)測關(guān)鍵性能指標(biāo)，并在出現(xiàn)問題時更快地進(jìn)行問題排查。更多布板示例請點擊這里獲取。
? HCP ELISA的關(guān)鍵考慮因素包括：復(fù)孔設(shè)置、樣品稀釋梯度、加樣和洗板的操作、對照的設(shè)置。
? 用低結(jié)合板來優(yōu)化加樣操作，可以最大程度減少OD值的偏差。
? 切勿使用空白對照，這樣做會提高檢測結(jié)果的變異系數(shù)。
相關(guān)產(chǎn)品推薦：
品名：Sample Treatment Plate （樣品處理板）
貨號：F402
規(guī)格：1 plate
Cygnus Technologies, LLC.為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家，Cygnus的產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被幾乎所有主要的生物制藥公司使用超過25年。
北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時間，降低QC成本。如您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.vaginalart.com了解更多信息。
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